亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法（fig.1）。
Figure 1亲和层析分离原理
亲和填料由三个部分组成的，主要是多孔球形基架,间隔臂及配基,根据配基特异性的不同亲和填料分几种，Ni柱纯化，GST亲和层析介质（（GST Agarose），麦芽糖结合蛋白(MBP)，FLAG-tag，Protein G,Protein A和Protein L亲和层析介质等。
Ni柱应该我们都比较熟悉，用于纯化带有 His6-Tag 的融合蛋白，是目前蛋白纯化中最常使用的一种方法。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有 HIs (组蛋白) 标签的碱性蛋白蛋白结合，在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。
Figure 2填料基本结构
GST亲和层析介质 (GST Agarose)是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质,一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白,纯化条件温和,可以保证蛋白的活性。麦芽糖结合蛋白(MBP)，FLAG-tag亲和层析主要纯化带有MBP和FLAG标签的蛋白。
对于IgG的纯化，大部分情况下我们都会选择使用Protein A或Protein G进行亲和层析。因为它们对于IgG的Fc段具有特异性的亲和作用。
其中 Protein A 是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量 42KD，因它对有FC结构域的抗体，融合蛋白的特异性结合和对高电导的 耐受性，使它拥有在亲和层析过程中允许将细胞发酵液直接上样和去除大部分工艺相关杂质的功能。因有这些优势，亲和填料在真核表达蛋白纯化工艺中最多用的填料，而且占全纯化工业成本的80%。
虽然亲和步骤能去除很多杂质，但亲和以后的有部分杂质还是会对下游工艺来说挺大的挑战，况且成本高，所以为了减少成本和提高效率要开发高载量，高收率和纯度高的亲和层析下游纯化工艺。
1.亲和层析填料的筛选
无论是单抗，双抗或者融合蛋白的纯化过程，选择合适的亲和填料特别重要，这步骤不仅会影响亲和步骤的成本，还会影响亲和后样品的纯度，收率及下一步纯化步骤的增加或者减少。
现在工艺最多用的亲和填料是Protein A填料，大部分Protein A填料主要跟IgG类抗体或者融合蛋白FC CH2-CH3区域结合，随着层析填料技术的发展最近开发了不仅跟FC CH2-CH3区域结合还有VH3链，CH1链，轻链（VL,CL）和Kappa链结合的填料。比如像Mabselect PrismA 填料不仅跟FC CH2-CH3区域结合还有VH3链结合；CaptureSelect CH1-LX填料跟重链CH1结合；Capto L填料跟轻链VL链结合；KappaSelect 和LambdaFabSelect填料跟轻链CL结合等。
Figure 3 IgG抗体结构
对Ultra Plus‐, MabSelect SuRe‐, 和KanCapA‐等三种亲和填料对同一种单抗纯化过程中去除聚集体能力比较实验结果表明，KanCapA在洗涤缓冲液中精氨酸在还是不在都能有效的去除聚集体和FC断裂的单抗残疾，而MabSelect SuRe 在洗涤缓冲液中加精氨酸情况下才能有效去除聚集体，Ultra Plus显示没有去除聚集体效果（Fig 4）。
Figure 4不同亲和填料对去除聚集体的影响
根据每个抗体或融合蛋白的特异性选择合适填料不仅能增加载量也会很好地去除聚体体，碎片，HCP,DNA残留，ProteinA残留和获取纯度高的蛋白洗脱液。
2.上样载量
根据工艺需求选好填料后下一步要对上样载量进行评估，亲和填料上样载量一般推荐在5分钟的保留时间10-50g/L,有的填料能达到60 g/L。研究表明高的载量会降低蛋白纯度，所以要上样载量控制在合适范围内。
3.洗涤缓冲液条件的优化
Figure 5洗涤缓冲液pH 和氯化钠浓度对去除HCP 和收率的影响
Figure 6不同添加剂和pH对去除HCP的影响
4.洗脱条件的优化
对亲和层析来说 洗脱pH 不仅对产品质量还对收率也有很大的影响，，对 ProteinA 层析洗脱pH推荐的范围3.2 -3.9 之内，最近发现有些填料来说洗脱pH提高到4.2 ；当然这可以根据蛋白和填料之间的相互作用的性质来调。洗脱收集体积推荐控制在2.0-3.2 CV之间。
5.结论
参考文献
[1] Affinity chromatography :Handbook from GE Healthcare ;
[2] Srinivas Chollangi , Ray Parker , Nripen Singh , Yi Li et.al.Development of Robust Antibody Purification by Optimizing Protein-A Chromatography in Combination With Precipitation Methodologies
[3] A-Mab: a case study in bioprocess development from CMC Working group ;
[4] Yifeng Li , Immunoglobulin-binding protein-based affinity chromatography in bispecific antibody purification :function beyond product capture: 188(2021)105976
[5] Biotechnol J. Choosing the right protein A affinity chromatography media can remove aggregates efficiently. 2017 Jan;12(1).
[6] Julia Bach and Lisa Connell-Crowley. Clearance of the Rodent Retrovirus, XMuLV, by Protein A Chromatography. Revision Received October 6, 2014;
来源： 抗体圈
声明：本平台注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！
